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植物提取物常見(jiàn)的5種檢測方法

2019-01-08

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　　目前植物提取物的檢測方法常見(jiàn)的有五種，分別為：高效液相色譜分析法(HPLC)、紫外吸收光譜分析法(UV)、薄層色譜分析法(TLC)、氣相色譜分析法(GC)和原子吸收光譜分析法(AAS)。
　　每一種方法的作用原理和應用都各不相同。其中，HPLC和UV為標準植物提取物的常用檢測方法，TLC被用于比例植物提取物的檢測，GC用來(lái)檢測揮發(fā)性液體或油類(lèi)，AAS用于提取物重金屬含量的檢測。
 
 
　　1、高效液相色譜分析法(HPLC)
　　HPLC全程是High Performance Liquid Chromatography（高效液相色譜法），又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫學(xué)、工業(yè)、農學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。近年來(lái)，在保健食品功效成分、營(yíng)養強化劑、維生素類(lèi)、蛋白質(zhì)的分離測定等應用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來(lái)分析測定。
　　1.1高效液相色譜分析的流程
　　由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類(lèi)似，不同的是氣相色譜改變溫度，
　　而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
　　1.2高效液相色譜的分離過(guò)程
　　同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
　　開(kāi)始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開(kāi)始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(cháng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A(yíng)，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。
　　不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(cháng)展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
 
 
　　2、紫外吸收光譜分析法(UV)
　　UV檢測法也是植物提取物常用的檢測方法之一，UV是英文名稱(chēng)ultraviolet的縮寫(xiě)，UV檢測也稱(chēng)紫外檢測法、紫外光譜檢測法。UV檢測法主要用于配合物組成及其穩定常數的測定，定量分析結構分析定性分析應用范圍定義紫外光譜是分子中某些價(jià)電子吸收了一定波長(cháng)的電磁波,由低能級躍近到高能級而產(chǎn)生的一種光譜當分子中的電子吸收能量后會(huì )從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后放出能量（輻射出特征譜線(xiàn)），回到基態(tài)；而輻射出特征普線(xiàn)的波長(cháng)在紫外區中就叫做紫外光譜（UV）
　　紫外光來(lái)自于一個(gè)水銀紫外燈，水銀紫外燈是通過(guò)藍寶石窗口以及過(guò)程流來(lái)獲取的。除了特定的紫外波長(cháng)，狹窄的波段通過(guò)紫外過(guò)濾器阻塞了所有的傳輸光線(xiàn)。這些紫外光能夠通過(guò)過(guò)濾器以及測試探測器只記錄特定的紫外波長(cháng)。
　　紫外光直接通過(guò)靠近燈的相同規格的紫外過(guò)濾器。參考探測器置于過(guò)濾器后邊，可以測試出當前的紫外強度。參考探測器信號用于彌補由于燈管老化，極端溫度變化等引起的紫外資源強度的起伏變化。通過(guò)測量及參考探測器給到的光電流結果將會(huì )通過(guò)傳送器進(jìn)行放大，修改，處理。傳送器實(shí)時(shí)的提供經(jīng)計算后的測量結果，且能夠向處理控制系統發(fā)送多個(gè)輸出值。
　　2.1 UV定性分析
　　在有機化合物的定性分析中，紫外－可見(jiàn)光譜適用于不飽和有機化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結構。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行定性鑒定和結構分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線(xiàn)和用經(jīng)驗規則計算最大吸收波長(cháng)λmax，然后與實(shí)測值進(jìn)行比較。結構分析??結構分析可用來(lái)確定化合物的構型和構象。如辨別順?lè )串悩嬻w和互變異構體。
　　2.2 UV定量分析
　　紫外－可見(jiàn)分光光度定量分析的依據是Lambert-Beer定律，即在一定波長(cháng)處被測定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線(xiàn)性關(guān)系。應此，通過(guò)測定溶液對一定波長(cháng)入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有：?jiǎn)谓M分定量法、多組分定量法、雙波長(cháng)法、示差分光光度法和導數光譜法等。配合物組成及其穩定常數的測定??測量配合物組成的常用方法有兩種：摩爾比法（又稱(chēng)飽和法）和等摩爾連續變化法（又稱(chēng)Job法）。酸堿離解常數的測定??光度法是測定分析化學(xué)中應用的指示劑或顯色劑離解常數的常用方法，該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
 
 
　　3、薄層色譜分析法(TLC)
　　薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱(chēng)薄層層析，屬于固－液吸附色譜。是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法，它兼備了柱色譜和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線(xiàn)，則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來(lái)精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，在進(jìn)行化學(xué)反應時(shí)，常利用薄層色譜觀(guān)察原料斑點(diǎn)的逐步消失來(lái)判斷反應是否完成。
　　薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10×3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線(xiàn)上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開(kāi)劑的展開(kāi)槽內，浸入深度為0.5cm。待展開(kāi)劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗技術(shù)，屬固—液吸附色譜，它兼備了柱色譜和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，因此，又可用來(lái)精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來(lái)跟蹤有機反應及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預試”。
 
 
　　4、氣相色譜分析法(GC)
　　GC：Gas Chromatography氣相色譜法用氣體作為移動(dòng)相的色譜法。根據所用固定相的不同可分為兩類(lèi)：固定相是固體的，稱(chēng)為氣固色譜法；固定相是液體的則稱(chēng)為氣液色譜法。
　　氣相色譜系統由盛在管柱內的吸附劑，或惰性固體上涂著(zhù)液體的固定相和不斷通過(guò)管柱的氣體的流動(dòng)相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入后，由于固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同，即各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數有差別，當組分在兩相中反復多次進(jìn)行分配并隨移動(dòng)相向前移動(dòng)時(shí)，各組分沿管柱運動(dòng)的速度就不同，分配系數小的組分被固定相滯留的時(shí)間短，能較快地從色譜柱末端流出。以各組分從柱末端流出的濃度c對進(jìn)樣后的時(shí)間t作圖，得到的圖稱(chēng)為色譜圖。當色譜過(guò)程為沖洗法方式時(shí)，組分在進(jìn)樣后至其最大濃度流出色譜柱時(shí)所需的保留時(shí)間tR，與組分通過(guò)色譜柱空間的時(shí)間tM，及組分在柱中被滯留的調整保留時(shí)間t惱的關(guān)系是：
　　式中t惱與tM的比值表示組分在固定相比在移動(dòng)相中滯留時(shí)間長(cháng)多少倍，稱(chēng)為容量因子k：
　　從色譜圖還可以看到，從柱后流出的色譜峰不是矩形，而是一條近似高斯分布的曲線(xiàn)，這是由于組分在色譜柱中移動(dòng)時(shí)，存在著(zhù)渦流擴散、縱向擴散和傳質(zhì)阻力等因素，因而造成區域擴張。在色譜柱內固定相有兩種存放方式，一種是柱內盛放顆粒狀吸附劑，或盛放涂敷有固定液的惰性固體顆?！草d體或稱(chēng)擔體（表2）〕；另一種是把固定液涂敷或化學(xué)交聯(lián)于毛細管柱的內壁。用前一種方法制備的色譜柱稱(chēng)為填充色譜柱，后一種方法制備的色譜柱稱(chēng)為毛細管色譜柱（或稱(chēng)開(kāi)管柱）。
　　通常借用蒸餾法的塔片概念來(lái)表示色譜柱的效能，例如使用“相當于一個(gè)理論塔片的高度“H或“塔片數”n來(lái)表示柱效。對于填充柱：
　　對于開(kāi)管柱：
　　式中λ是與填充均勻性有關(guān)的因素，稱(chēng)為填充不規則因子；γ是柱內填充物使得氣體擴散路徑彎曲的因素，稱(chēng)為彎曲因子；dp是填充物平均顆粒直徑（即粒度）；u是載氣在柱溫、柱壓下的線(xiàn)速；Dg是組分在氣相中的分子擴散系數；Dl是組分在液相的擴散系數；df是固定液的液膜厚度；dc是開(kāi)管柱的內徑。所以色譜柱的塔片數n=L/H，式中L為色譜柱長(cháng)；n的數值可用給定的物質(zhì)作實(shí)驗，由實(shí)驗所得到的色譜圖（圖1）計算得到：
　　式中ω┩為色譜峰的半高寬，由于氣相色譜的組分在固定液中的分配等溫線(xiàn)多為線(xiàn)性，如果進(jìn)樣量很小，得到的色譜峰流出曲線(xiàn)最初是用高斯正態(tài)分布來(lái)描述的，其數學(xué)表示式為：
　　現在實(shí)驗和理論上都證明了物質(zhì)的色譜峰形狀是不對稱(chēng)的和曳尾的，若用指數衰減修正的高斯分布作為描述色譜峰形狀的分布函數，則更為確切：
　　式中A表示峰面積；tG表示高斯峰的中心位置；σ表示高斯峰的標準方差；τ表示指數衰減函數的時(shí)間常數；t′為積分變量。
　　上面曾經(jīng)指出，兩組分的分配系數必須有差異，其色譜峰才能被分開(kāi)。有了差異，分離時(shí)所需的柱效n也就不相同，所以要判別兩色譜峰分離的情況（圖2），還需要采用色譜柱總分離效能指標R：
　　n與R的關(guān)系為：
　　式中α′是組分相對保留值；α是組分校正相對保留值。從上式可知，選擇適宜固定液和具有給定塔片數的色譜柱后，應該通過(guò)改變色譜柱溫來(lái)調節α′值，從而滿(mǎn)足將兩組分分離至給定R值的分離程度。
 
 
　　5、原子吸收光譜法（AAS）
　　原子吸收光譜法（AAS），全稱(chēng)是Atomic Absorption Spectrometry
　　AAS基本原理：
　　每一種元素的原子不僅可以發(fā)射一系列特征譜線(xiàn)，也可以吸收與發(fā)射線(xiàn)波原子吸收光譜原理圖
　　長(cháng)相同的特征譜線(xiàn)。當光源發(fā)射的某一特征波長(cháng)的光通過(guò)原子蒸氣時(shí)，即入射輻射的頻率等于原子中的電子由基態(tài)躍遷到較高能態(tài)（一般情況下都是第一激發(fā)態(tài)）所需要的能量頻率時(shí)，原子中的外層電子將選擇性地吸收其同種元素所發(fā)射的特征譜線(xiàn)，使入射光減弱。特征譜線(xiàn)因吸收而減弱的程度稱(chēng)吸光度A，與被測元素的含量成正比：式中K為常數；C為試樣濃度；I0v為原始光源強度;Iv為吸收后特征譜線(xiàn)的強度。按上式可從所測未知試樣的吸光度，對照著(zhù)已知濃度的標準系列曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析。由于原子能級是量子化的，因此，在所有的情況下，原子對輻射的吸收都是有選擇性的。由于各元素的原子結構和外層電子的排布不同，元素從基態(tài)躍遷至第一激發(fā)態(tài)時(shí)吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收線(xiàn)具有不同的特征。原子吸收光譜位于光譜的紫外區和可見(jiàn)區。
 
 
 

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